當(dāng)我們需要運(yùn)輸或者長期不用某種細(xì)胞時(shí)，通常會使用凍存的方法來保存。若未做好細(xì)胞凍存，還會直接影響后續(xù)細(xì)胞復(fù)蘇狀態(tài)，所以細(xì)胞凍存的重要性不容小覷。
 

　　本期信裕細(xì)胞學(xué)堂將帶來貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的凍存操作步驟及注意事項(xiàng)，以便大家查漏補(bǔ)缺。
 

　　在進(jìn)行凍存操作前，可預(yù)先配置好凍存液；若使用無血清非程序凍存液，則無需自己配制，也無需使用程序降溫盒。
 

　　01貼壁細(xì)胞凍存操作
 

　　◆ 將待操作的細(xì)胞去上清，用PBS潤洗；
 

　　◆ 去上清，加入Pancreatic enzymes消化，消化完成后加入completely培養(yǎng)基終止消化，并吹打均勻制備成細(xì)胞懸液；
 

　　◆ 1200rpm(250g)3min離心后盡量吸干凈上清，收集細(xì)胞沉淀；
 

　　◆ 加入配置好的凍存液重懸，一個(gè)T25培養(yǎng)瓶長到80%左右密度的細(xì)胞量可凍存1支，或者細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照3~5×106cells/支凍存，凍存液用量推薦0.5~1mL/支；
 

　　◆ 分裝完畢后，擰緊凍存管蓋并做好標(biāo)記；
 

　　◆ 將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒，放入-80℃冰箱過夜；
 

　　◆ 最后將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮長期保存。
 

　　02懸浮細(xì)胞凍存操作
 

　　?直接將細(xì)胞懸液于1200rpm(約250g)3分鐘離心后盡量吸干凈上清，收集細(xì)胞沉淀；
 

　　? 去上清，用配置好的凍存液重懸細(xì)胞，一個(gè)T25培養(yǎng)瓶長到傳代密度時(shí)的細(xì)胞量可凍存1支，或者細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照3~5×106cells/支凍存，凍存液用量推薦0.5~1mL/支；
 

　　? 分裝完畢后，擰緊凍存管蓋并做好標(biāo)記；
 

　　? 將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒，放入-80℃冰箱過夜；
 

　　? 再轉(zhuǎn)移至液氮長期保存。
 

　　注意事項(xiàng)
 

　　01細(xì)胞凍存液需提前配制，不可直接將DMSO加入細(xì)胞懸液中；
 

　　02應(yīng)選擇匯合度80%-90%左右，處于對數(shù)生長期時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行凍存操作，確保細(xì)胞凍存時(shí)狀態(tài)最佳，凍存密度可根據(jù)細(xì)胞特性進(jìn)行調(diào)整；
 

　　03程序凍存盒、細(xì)胞凍存液、completely培養(yǎng)基等試劑都要復(fù)溫至室溫備用；
 

　　04凍存前注意切勿消化時(shí)間過長、吹打力度過重、離心轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長，以免造成細(xì)胞損傷；
 

　　05凍存細(xì)胞長期保存應(yīng)放置于液氮，不建議在-80℃長期保存；