脾臟是機體重要的免疫器官之一，含有大量的淋巴細胞，占全身淋巴組織總量的25%，在小鼠中，由于小鼠血液量少，從外周血液中分離大量淋巴細胞較為困難，故經常需要從其脾臟中獲取大量的淋巴細胞。

不久前，來自華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院的李老師在Biomaterials雜志上發布的文章中就用到了上述實驗。以下為是李老師分享的一些相關經驗。

操作步驟

1 材料準備

選取具有正常免疫功能的成年小鼠（所需的小鼠數量根據實驗需要決定，通常一只小鼠脾臟可提取的淋巴細胞數量為2~6×10⁷），快速斷頸處死(避免脾梗死)后，浸泡于75%酒精中；準備好已消毒的眼科剪、眼科鑷，以及一個裝有一定量PBS的無菌皿，分離脾臟后置于皿中，全程無菌操作；

2 小鼠脾臟處理

脾臟細胞數量較少時，可用兩個1mL無菌注射器的針尖將脾臟戳出大量的空洞后，輕輕刮取脾臟表面，將脾臟細胞刮出；數量較多時，可用細胞濾網進行研磨后離心，也可得到淋巴細胞。

3 離心

15mL離心管中吸入5mL ficoll分離液，傾斜管身，小心吸取含淋巴細胞的PBS緩慢加入ficoll分離液，可見明顯液體分層。600rpm梯度離心25分鐘，升速/降速均為2；

4 二次離心

得到分為3層的液體, 小心吸取中間層液體（含淋巴細胞+紅細胞）并置于新的15mL離心管，補滿PBS，600rpm離心5分鐘；

5 三次離心

棄上清PBS, 可見黑紅色沉淀，加入1~2mL紅細胞裂解液，冰上裂解5分鐘，補滿PBS, 600rpm離心5分鐘；

6 獲取淋巴細胞

棄上清PBS, 可見白色沉淀，此為總淋巴細胞；計數；

7 重懸淋巴細胞

將提前過夜包被CD3抗體(包被濃度為5ug/mL)的96孔板中的PBS吸棄，配制淋巴細胞培養基，1640全培+巰基乙醇+CD28抗體(終濃度2.5ug/mL)，重懸淋巴細胞并加入96孔板，100~200ul/孔，通常淋巴細胞數量為1~3×10⁵個/孔。通常8個小時即可看到T細胞增殖團，刺激48h后可以較好活化T淋巴細胞；

8 分選

若實驗目的為分選CD4/CD8 T淋巴細胞，可以省去紅細胞裂解操作，直接用磁珠抗體對淋巴細胞進行避光孵育，并用PBS洗掉多余的試劑后，棄上清，用一定量PBS重懸淋巴細胞，緩慢加入預先潤濕過的macs tube(已安裝到磁力架上)。根據具體試劑和目的可以分為陰選和陽選：陰選需要從分選柱中流下的液體，其中含有目的細胞；陽選則應該等待分選柱中的液體流盡后，將分選柱從磁力架上取下后，并重新加入PBS將分選柱中的陽選細胞沖下，其中含有目的細胞。計數，此后步驟同總淋巴細胞。

注意事項

1   由于整個過程需要淋巴細胞長時間處于體外PBS中，所以對PBS的要求比較嚴格；為保護淋巴細胞，也可以使用專門的淋巴細胞緩沖液，或自行配制含0.4%BSA的PBS緩沖液；

2   有些研究為了更好地促進淋巴細胞的殺傷功能，還會在T細胞培養基中添加IL-2; 但是，很多人認為這樣也會加速T細胞進入T細胞耗竭的進程，同時會縮短T細胞壽命；

3   若后續需要進行流式分析，無法再染CD3 和 CD28分子；

4   若用到了OT-I CD8 T細胞，則無需CD3抗體刺激，而是用OVA抗原刺激活化第一信號；

5   以上所有操作均以無菌試劑、耗材，無菌環境內操作為前提。

 
以上為淋巴細胞提取、分選的經驗分享，希望對大家有所幫助。同時也歡迎更多老師參與文獻獎勵活動，分享您的科研干貨和心得體會！